转录组上游-windows使用kallisto-从cleandata到表达矩阵

由于我linux系统崩了，于是我开始探索再windows环境完成RNA-seq分析，实际情况是windows完全够用（如果内存足够），不然还是选择用服务器分析。

网上对于kallisto的使用教程并不详细，也主要集中在linux系统，于是我想分享一下我使用kallisto的经验。这是我的分析流程，大家可以参考一下。

1.安装kallisto

kallisto是一个免费的转录组拼接软件，在linux和windows-CMD里都可以运行，使得你的row data被拼接为可以进行下游操作的read count这样的matrix。以下是下载安装的官网：

https://pachterlab.github.io/kallisto/download

下载到你能找得到的位置（很关键，因为等下要转到这个工作目录）下载后在文件夹里看到这样就成功下载安装了：

2.在CMD中运行kallisto

我们使用windows的命令行来操作，Win+R打开运行，输入cmd进入命令行窗口；

然后我们要cd我们的工作目录到kallisto的目录：

>cd C:\Users\Huzhuocheng\Desktop\毕业设计\转录组\转录组上游\kallisto\kallisto

这样就欧克了，我们已经在kallisti的工作目录里了；

3.获取CDS或者exon建立Index

现在的转录组分析大多是有参转录组的分析了，不过kallisto也只能做有参的，因此要先建立索引。我们不能用全基因组做参考，这样切出来会一坨一坨的，因此我们需要先获得CDS序列或者exon序列再来建立Index，这里我推荐使用TBtools获取，TBtools转换需要两个文件：

（1）全基因组.fa（2）基因组注释文件.gff3

（没有这些文件的话可以在ncbi上找，我也会出教程，但是如果是冷门模式生物，比如我的萨氏海鞘，就可以问问实验室的大老板应该是有基因组文件的）

这样获得的CDS.fa 或者 exon.fa就可以用来建立Index，当然具体用CDS还是exon可以自己选，我做出来发现CDS表达量高一些，CDS（Coding Sequence）和exon（外显子）都是基因结构中的重要组成部分。CDS指的是一段特定的DNA序列，它包含了用于编码蛋白质的所有信息。具体来说，CDS是从基因的起始密码子（通常是ATG）开始，一直到终止密码子（可以是TAA、TAG或TGA）结束的一段序列。在这段序列中，每一个三联体密码子对应着蛋白质中的一个氨基酸，因此CDS是基因表达成蛋白质的直接模板。

另一方面，exon则是指真核生物基因中的编码序列，这些序列在RNA剪接过程中会被保留下来，并最终构成成熟的mRNA分子。外显子本身可以跨越几个不同的DNA片段，并且在剪接过程中会被连接在一起，形成连续的mRNA序列。

总的来说，CDS关注的是DNA序列中负责编码蛋白质的部分，而exon则是从DNA层面描述哪些序列会在最终的mRNA中被表达出来。

4.kallisto建立Index

在刚刚的cmd里输入kallisto index会跳出指令教程：

用法（Usage）‌:

kallisto index [arguments] FASTA-files
#example
C:\Users\Huzhuocheng\Desktop\毕业设计\转录组\转录组上游\kallisto\kallisto>kallisto index -i D:\CDS.idx D:\CDS.fa

kallisto index -i 你的输出位置 你的CDS文件位置

必需的参数（Required argument）‌:

• -i, --index=STRING: 你需要指定一个输出文件的名称，Kallisto将用这个文件名来保存生成的索引。

可选的参数（Optional argument）‌:

• -k, --kmer-size=INT: 这个参数允许你设置k-mer的长度。k-mer是在构建索引过程中使用的短序列片段，通常长度为奇数个碱基对。默认值是31，最大值也是31。
• --make-unique: 如果你的输入文件中包含重复的目标名称（例如不同的转录本具有相同的名称），你可以使用此选项让Kallisto生成唯一的名称以区分它们。

看到这样的反馈就是成功了：

5.kallisto进行双端转录组测序数据定量

kallisto可以对双端和单端的测序数据进行比对，我这里以双端的为例。

在cmd里输入kallisto quant后，会出现比对指令表：

Required arguments:‌ 这一部分列出了运行Kallisto时必须要提供的参数：
-i, --index=STRING: 指定用于定量分析的Kallisto索引文件的名称。
-o, --output-dir=STRING: 指定输出结果的目录路径。
Optional arguments:‌ 接下来列出的是一些可选参数，用户可以根据需要选择是否提供这些参数：
--bias: 执行基于序列的偏差校正。
-b, --bootstrap-samples=INT: 设置bootstrap采样的数量，默认为0。
--seed=INT: 设置bootstrap采样的种子值，默认为42。
--plaintext: 以纯文本形式输出结果，而不是HDF5格式。
--fusion: 为Pizzly搜索融合事件。
--single: 对单端读取数据进行定量。
--single-overhang: 包括预测其未观察到的片段剩余部分位于转录本之外的读取。
--fr-stranded: 针对正向链特异性读取（第一读取为正向）。
--rf-stranded: 针对反向链特异性读取（第一读取为反向）。
-l, --fragment-length=DOUBLE: 估计的平均片段长度。
-s, --sd=DOUBLE: 估计的片段长度的标准差，默认情况下是从配对末端数据中估计出来的，但在使用--single时需要明确指定。
-t, --threads=INT: 要使用的线程数，默认为1。
--pseudobam: 将伪比对到转录本的记录保存为BAM文件。
--genomebam: 将伪比对投影到基因组并生成排序后的BAM文件。
-g, --gtf: 包含转录本信息的GTF文件，对于--genomebam选项是必需的。
-c, --chromosomes: 染色体名称和长度的制表符分隔文件，对于--genomebam选项是可选的，但推荐使用

大部分指令用不到，可以直接看我的示例：

C:\Users\Huzhuocheng\Desktop\毕业设计\转录组\转录组上游\kallisto\kallisto>kallisto quant -i D:\CDS.idx -o D:\second\HSL-1-1 D:\trans\clean\Unknown_BT072-002T0001_good_1.fq D:\trans\clean\Unknown_BT072-002T0001_good_2.fq
########格式
>kallisto quant -i index位置 -o 输出文件位置 第一个fq文件位置 第二个fq文件位置

看到这样就是运行成功了，可以去输出文件下看一下输出的文件。

6.使用kallisto2matrix转为read counts文件

刚刚得到的abundance文件还是不能直接分析，我们是想得到表达量的matrix文件。

下载地址是：GitHub - yukaiquan/kallisto2matrix: kallisto/salmon result to matrix (TPM,Count,FPKM)

我把它安装到了kallisto同一个目录，也是可以在CMD进行运行的

这样就安装成功了。

我们需要在这个工作目录下新建一个txt文件，里面放着我们刚刚得到的多个样本的abundance文件，然后运行指令就可以输出了。

C:\Users\Huzhuocheng\Desktop\毕业设计\转录组\转录组上游\kallisto\kallisto>kallisto2matrix.exe -i C:\Users\Huzhuocheng\Desktop\毕业设计\转录组\转录组上游\kallisto\kallisto\example.txt -o test

输出得到的是count/tpm/fpkm三个矩阵

1. Counts矩阵代表原始的读数（read counts），它记录了每个样本中每条基因序列被测序仪检测到的次数。这是一个绝对数值，反映了测序的深度和基因的长度。由于这些因素可能导致不同样本或基因之间的直接比较存在偏差，因此通常需要通过其他形式的标准化来处理。

2. FPKM（Fragments Per Kilobase of transcript per Million mapped reads）矩阵是一种标准化后的表达量度量单位，旨在解决由基因长度和测序深度带来的问题。FPKM首先考虑了基因的长度，然后根据每个样本中映射到基因组的读取总数进行调整。具体来说，FPKM通过将每个基因的片段数（fragments）除以该基因的长度（以千碱基为单位），再乘以一百万（因为测序深度可能达到数百万级别），从而使得不同长度的基因和不同测序深度的样本之间可以进行比较。

3. TPM（Transcripts Per Million）矩阵也是用来标准化基因表达量的一种方法，它与FPKM的主要区别在于调整顺序的不同。TPM先对每个样本的所有基因的读数进行归一化，然后再除以基因的长度。这种计算方法有助于在不同的样本之间进行更准确的比较，尤其是在跨样本分析时。TPM的一个显著特点是，所有样本中所有基因的TPM值加起来等于同一个常数（通常是1百万），这使得TPM非常适合于描述样本中基因表达的相对比例。

总结来说，这三个矩阵代表了从原始数据到标准化表达量的不同阶段。Counts矩阵提供了最基础的读数信息，而FPKM和TPM则是对这些数据进行标准化处理后得到的表达量度量，它们帮助我们在不同样本间进行更有意义的比较和分析。

结语

以上就是从转录组raw data到表达量数据的全过程，后续的分析我也会出教程，有什么问题可以评论交流。谢谢大家！