【Bioinfo Blog 013】【R Code 011】——甲基化芯片数据分析（ChAMP包）_champ block.gui

一、甲基化芯片检测

1.1 DNA甲基化

DNA甲基化是表观遗传学的中最为常见的一种修饰，其主要形式包括：5-甲基胞嘧啶 (5-mC)、少量的N6-甲基腺嘌呤 (N6-mA) 以及7-甲基鸟嘌呤(7-mG)。

目前常说的DNA甲基化一般指CpG岛甲基化，即在DNA甲基化转移酶（DNMTs）的作用下使CpG二核苷酸5’端的胞嘧啶转变为5’甲基胞嘧啶。

CpG岛（CpG islands）:指CpG序列密度相比整个基因组来说是特别高的富集区域，一般位于启动子附近，5’端非翻译区或第一个外显子；一般CpG岛序列长度在500bp以上，GC含量高于55%以及CpG出现比率大于0.65，40%的启动子区域含有CpG岛。
CpG shores指距CpG岛边缘2kb的区域
CpG shelves是指距CpG岛边缘4kb的区域

1.2 甲基化芯片原理

甲基化芯片的原理是基于亚硫酸盐处理后的DNA序列杂交的信号探测。

• 亚硫酸盐是甲基化探测的“金标准”，不管是芯片或者甲基化测序，都要先对DNA样品进行亚硫酸盐处理，使非甲基化的C变成U，而甲基化的C保持不变，从而在后续的测序或者杂交后区分出来。
• 450K采用了两种探针对甲基化进行测定，Infinium I采用了两种bead（甲基化M和非甲基化U，如图显示），而Infinium II只有一种bead（即甲基化和非甲基化在一起），这也导致了它们在后续荧光探测的不同，450K采用了两种荧光探测信号（红光和绿光）。

上图左边一列是非甲基化的GpC locus，右边是甲基化的GpC locus，上下分别是Infinium I 和Infinium Ⅱ

1.3 β值

通过计算甲基化（信号A）和未甲基化（信号B）等位基因之间的强度比来确定DNA甲基化水平（β值）。

平均β=信号B /(信号A +信号B + 100)

具体地，β值是由甲基化（M对应于信号A）和未甲基化（U对应于信号B）等位基因的强度计算的，荧光信号的比率β= Max（M，0）/ [Max（ M，0）+ Max（U，0）+ 100]。
因此，β值的范围从0（完全未甲基化）到1（完全甲基化）

具体的β值的意义是：
任何等于或大于0.6的β值都被认为是完全甲基化的。
任何等于或小于0.2的β值被认为是完全未甲基化的。
β值在0.2和0.6之间被认为是部分甲基化的。

1.4 分析需要考虑的问题

1. 背景校正

2. 红光和绿光的校正

3. 控制芯片的使用（illumina450K本身有一些控制芯片，可以用来做质控，如亚硫酸盐处理效率）

4. 探针类型（I型和II型）的校正（不同探针类型产生的数据不同）

5. 位置的校正（芯片上的不同位置产生的数据可能会有偏差）

6. 批次的校正（不同的批次做的数据会有偏差）

7. 探针序列本身是否可靠（有些探针本身位于repeat区或者包含snp等就会影响杂交及最后的结果，应该去除，附上一片参考文献，里边有list可以用来去除不好的探针）

二、甲基化芯片数据分析

图源：ChAMP: updated methylation analysis pipeline for Illumina BeadChips

• 绿色发光线表示主要的分析步骤，灰色为可选的步骤。黑点表示准备好的甲基化数据。
• 蓝色表示准备工作，比如Loading, Normalization, Quality Control checks etc.
• 红色表示产生分析结果：Differentially Methylated Positions (DMPs), Differentially Methylated Regions (DMRs), Differentially methylated Blocks, EpiMod (a method for detecting differentially methylated gene modules derived from FEM package), Pathway Enrichment Results etc.
• 黄色表示交互界面画图

2.1 Pipeline

2.1.1 450K

myLoad <- cham.load(testDir)
# Or you may separate about code as champ.import(testDir) + champ.filter()
CpG.GUI()
champ.QC() # Alternatively: QC.GUI()
myNorm <- champ.norm()
champ.SVD()
# If Batch detected, run champ.runCombat() here.
myDMP <- champ.DMP()
DMP.GUI()
1
2
3
4
5
6
7
8