人类肝脏的单细胞、单核和空间 RNA 测序可识别胆管细胞和间充质异质性_单细胞rna测序

hello，周二了，隔离的第二天，一个人的日子总是难熬，耐得住寂寞的人，都成了圣人~~~，今天我们分享的文献在Single-Cell, Single-Nucleus, and Spatial RNA Sequencing of the Human Liver Identifies Cholangiocyte and Mesenchymal Heterogeneity,题目上就可以看出来，运用到了单细胞转录组，单核转录组，和空间转录组，2021年10月发表于Hepatology Communications,我们今天就来分享一下。

前面我们总结一下单核和单细胞转录组的优缺点

scrna：

• 优势：scRNA-seq 才能区分 T 和 B 淋巴细胞和自然杀伤细胞；
• 劣势：组织解离会限制完全捕获人类肝脏实质细胞部分的能力；可能会在细胞中引入应激反应；线粒体基因组编码的基因和编码线粒体蛋白的核基因在 scRNA-seq 中的表达更高；细胞类型频率在 scRNA-seq 中被扭曲。

snrna

• 优势：SnRNA-seq 比 scRNA-seq 捕获了更多的基因多样性；长链非编码 RNA 在 snRNA-seq 中的表达比 scRNA-seq 高；
• 劣势：snRNA-seq 包含的环境 RNA 比例显著高于 scRNA-seq；

Abstract

人类肝脏的关键功能是通过肝实质细胞和非实质细胞的相互作用来协调的。单细胞转录方法的最新进展使得能够以前所未有的分辨率检查人类肝脏。然而，与解离相关的细胞扰动会限制完全捕获人类肝脏实质细胞部分的能力，从而限制了全面分析该器官的能力。在这里，使用匹配的单细胞 RNA 测序 (scRNA-seq) 和单核 RNA 测序 (snRNA-seq) 报告了来自人类肝脏的 73,295 个细胞的转录情况。 snRNA-seq 的添加能够以单细胞分辨率表征区域间肝细胞，揭示肝间充质细胞罕见亚型的存在，并有助于检测仅在体外分化实验中观察到的胆管细胞祖细胞。然而，只有使用 scRNA-seq 才能区分 T 和 B 淋巴细胞和自然杀伤细胞，突出了应用这两种技术来获得组织驻留细胞类型的完整图谱的重要性。通过独立的空间转录组学数据集和免疫组织化学验证了肝细胞、胆管细胞和间充质细胞群的不同空间分布。结论：研究对 scRNA-seq 和 snRNA-seq 捕获的转录组进行了系统比较，并提供了健康人肝脏中实质细胞群的高分辨率图谱。

Introduction

肝脏是负责关键功能的重要器官，包括脂质和葡萄糖代谢、蛋白质合成、胆汁分泌和免疫功能。 单细胞 RNA 测序 (scRNA-seq) 技术能够分析单个细胞的转录组，并为人类肝脏的发育、生理学和病理学提供了重要的见解。 这些研究揭示了人类肝脏生理学以前无法获得的方面，例如肝小叶分区、细胞间相互作用以及免疫细胞表型和异质性。

此前，通过 scRNA-seq 检查了人类肝脏的细胞复杂性，并确定了 20 个不同的细胞clusters，包括两个不同的具有免疫调节和炎症特性的肝脏驻留巨噬细胞群。这项工作的观察结果是酶促和机械解离人类肝脏组织的数量显着影响肝脏图谱的组成，因为肝细胞对解离诱导的损伤很敏感，而我们的解离技术不能很好地释放胆管细胞和肝间充质细胞，如肝星状细胞 (HSC)（单细胞的解离技术还是对细胞有很大的损伤）。例如，胆管细胞（即形成胆管的实质细胞，预计占所有肝细胞的 3%-5%）仅由我们的 8,444 个细胞 scRNA-seq 图的 199 个 (0.64%) 细胞组成.捕获胆管细胞异质性是了解胆管病发病机制的关键，例如原发性硬化性胆管炎，目前尚无治愈性治疗干预措施。

单核 RNA 测序 (snRNA-seq) 是一种绕过 scRNA-seq 所需的细胞解离步骤的方法，它使用去污剂从完整细胞中释放细胞核。 SnRNA-seq 数据还与可从组织档案中获得的速冻样本兼容。最近，Slyper 等人评估了三种不同的核分离方案，用于从冷冻组织中提取 snRNA-seq，每种方案都使用不同的基于洗涤剂的缓冲液：Nonidet P40 与盐和 Tris (NST)、Tween-20 与盐和 Tris (TST)，以及CHAPS 含盐和 Tris (CST)。在这里，使用这三种protocols进行了匹配的 snRNA-seq，并使用发布的实验和分析工作流程对四个健康的人类肝脏样本进行了 scRNA-seq。在同一样本上使用多个protocols能够评估这三种 snRNA-seq protocols与 scRNA-seq protocols相比减少解离相关效应的能力，对比每种协议测量的细胞表达谱，并开发一种整合方法将结果整合到更全面的单一map中。

工作突出了应用于人类肝脏的 snRNA-seq 和 scRNA-seq 技术之间的细胞类型组成差异，并揭示了 snRNA-seq 数据特有的胆管细胞和肝间充质细胞亚群，这些亚群以前在单细胞转录组学研究中未发现。（单核作为补充，更加具有说服力）。结合这两种技术的结果创建了一个丰富的数据集，用于解释人类肝脏生物学，以及识别两种技术中定义关键细胞类型的标记基因 。

Results

EXAMINING THE QUALITY OF LIVER MAPPING VIA SCRNA -SEQ VERSUS SNRNA -SEQ（scrna vs snrna）

单细胞和单核转录组是从四个健康的人类肝脏中产生的，这些肝脏来自正在接受移植到活体受体的神经系统死亡供体。 总共从新鲜的肝脏解离物中捕获了 29,432 个单细胞，从匹配的速冻组织中捕获了 43,863 个单核，并使用 10× Chromium 平台进行了测序。 这些数据经过相同的质量控制处理，并系统地比较匹配的样本。

SnRNA-seq 比 scRNA-seq 捕获了更多的基因多样性。 这些差异主要是由于 scRNA-seq 数据中独特分子标识符的比例很高，这些独特分子标识符来自编码核糖体蛋白的转录本和线粒体基因组中编码的基因，而这些在 snRNA-seq 数据中不存在。 在用于提取细胞核的不同去污剂之间观察到最小的差异。 此外，对于大多数样本，snRNA-seq 包含的环境 RNA 比例显着高于 scRNA-seq，由 SoupX 估计得到的结果（这一段是比较单核和单细胞之间的优劣势）。

INTEGRATING SCRNA -SEQ AND SNRNA -SEQ MAPS

使用典型的计算处理流程，scRNA-seq 和 snRNA-seq 数据不会聚集在一起，因为细胞核中发现的 RNA 与细胞质之间存在系统差异（技术带来的批次效应还是难以逾越）。 在组织处理和细胞处理过程中可能会引入额外的技术混杂效应。 scRNA-seq 样本来源于酶解和机械解离的新鲜组织，这可能会在细胞中引入应激反应。 相比之下，snRNA-seq 样本是从快速冷冻的组织中提取的，受解离相关应力的影响应该较小。 此外，当使用相同的测序技术时，我们发现个体供体之间存在显着的批次效应，特别是在肝细胞中。 这可能与环境对肝脏代谢的影响有关，并且与我们之前报道的 scRNA-seq 肝脏图谱一致。

SYSTEMATIC DIFFERENCES IN NUCLEAR AND WHOLE-CELL TRANSCRIPTOMES

单独扩展数据集以整合 scRNA-seq 和 snRNA-seq 的必要性表明，这些技术生成的数据之间存在显着的系统基因表达差异。检查这些系统差异表达的基因表明，基因功能和基因长度都与通过 scRNA-seq 或 snRNA-seq 测量的表达密切相关。由线粒体基因组编码的基因和编码线粒体蛋白的核基因在 scRNA-seq 中的表达更高。同样，编码核糖体相关蛋白的 mRNA 在 scRNA-seq 中的表达比在 snRNA-seq 中高 4 倍多。这是意料之中的，因为线粒体和核糖体普遍存在于肝细胞（尤其是肝细胞）的细胞质中，而 snRNA-seq 材料输入中大多缺少细胞质。相比之下，其他“看家”蛋白质编码基因在 snRNA-seq 和 scRNA-seq 中同样表达。与其他组织的结果一致，长链非编码 RNA 在 snRNA-seq 中的表达比 scRNA-seq 高 0.7 倍；然而，这与其他非管家蛋白质编码基因没有显着差异，后者在 snRNA-seq 中的表达高 0.8 倍.

除了基因功能，总基因长度与 snRNA-seq 与 scRNA-seq 中的相对表达具有最强的相关性。 较长的基因 (>37 kb) 在 snRNA-seq 中的表达更高，而短的基因 (<15 kb) 在 scRNA-seq 中的表达更高。 即使在排除核糖体和线粒体相关基因后也是如此。 (这方面以前还真没注意到)。

CELLS OF THE HUMAN LIVER AS REVEALE D BY SCRNA -SEQ VERSUS SNRNA -SEQ

整合后（整合的方法我们下面分享），使用已知标记对数据进行聚类和注释； 结果图显示了所有主要的已知肝细胞类型。 这些细胞类型在 scRNA-seq 和 snRNA-seq 以及所有样本中都有代表，但以不同的频率捕获。 特别是，与具有 3% 淋巴细胞和 5% 巨噬细胞的 snRNA 序列相比，scRNA-seq 捕获了更高比例的免疫细胞，其中 7% 的细胞被测序确定为淋巴细胞，9% 被确定为巨噬细胞。 相比之下，snRNA-seq 捕获的胆管细胞和肝间充质细胞比 scRNA-seq 多 50%。 我们用这两种方法获得了相似百分比的肝窦内皮细胞 (LSEC) 和内皮细胞。 然而，这些频率取决于用于 snRNA-seq 的洗涤剂。 CST 和 NST 提取了较高频率的 LSEC（分别为 25% 和 20%）和较高频率的间充质细胞（CST 中为 7%，NST 中为 12%），但肝细胞的频率较低。

HEPATOCYTES

肝细胞是肝小叶的主要实质细胞，负责大部分肝功能。它们表现出从中央周围静脉到门静脉周围区域的功能分区。最近的工作已经证明了区域间肝细胞对肝脏稳态和再生的重要性，但由于缺乏已知的标记物，它们很难识别。对我们的肝细胞clusters进行亚聚类显示了来自 scRNA-seq 和 snRNA-seq 的六个不同的clusters，以及在所有样本中。将这些clusters与小鼠肝小叶显微解剖区域的分区表达相关联，可以将这些clusters中的三个注释为包含中央周围或门静脉周围肝细胞。这些注释使用已知的周围标记基因（细胞色素 P450 3A4 [CYP3A4]、乙醇脱氢酶 4 [ADH4]、谷氨酸氨连接酶 [GLUL] 和丁酰胆碱酯酶 [BCHE]）和门静脉标记基因（组氨酸解氨酶 [HAL] 、氨基甲酰磷酸合酶 1 [CPS1] 和 3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶 A 合酶 1 [HMGCS1])。在剩下的三个亚群中，一个与小鼠第 7 层相关性最强；另一个与小鼠第 5 层相关性最强，表明这两个clusters（IZ1 和 IZ2）代表人类区域间肝细胞。我们通过将其与源自人类显微解剖肝小叶区域的大量 RNA-seq 进行比较来验证推定的区域间肝细胞身份，其中这些clusters与区域间层 4 的相关性最强。从这两个clusters（组氨酸三联体核苷酸结合蛋白 1 [HINT1] 、细胞色素 C 氧化酶亚基 7C [COX7C]、载脂蛋白 C1 [APOC1]、脂肪酸结合蛋白 1、肝脏 [FABP1]、金属硫蛋白 2A [MT2A]、金属硫蛋白 1G [MT1G] 和泛醌氧化还原酶亚基 B1 [NDUFB1]）进行了验证使用空间转录组学和免疫组织化学，它们表现出与周围或中心标记明显不同的表达模式，但仍然模棱两可（具有不确定性）。

最后一组表达白蛋白 (ALB) 的肝细胞表达门静脉周围肝细胞标志物，如丝氨酸蛋白酶抑制剂家族 A 成员 1 (SERPINA1)、转甲状腺素蛋白 (TTR)、载脂蛋白 A1 (APOA1) 和载脂蛋白 C3 (APOC3)。 然而，该cluster与门静脉周围的小鼠血窦区域没有强烈的相关性，也没有表达许多其他的门静脉周围标记基因，如 HAL、CPS1 和 HMGCS1。 此外，表达谱与人类血窦的带间层 4 相关性最强，但与任何小鼠分区层无关（顶部差异表达基因 (DE)：ALB、SERPINA1、APOA1、触珠蛋白 [HP]、铁蛋白轻链 [FTL]、APOC3、血清淀粉样蛋白 A1 [SAA1]、稳定蛋白 1 [STAB1]、TTR、β-2-微球蛋白 [B2M] 和 LIF 受体亚基 α [LIFR]）。 这些结果表明该cluster可能代表人类特异性的区域间肝细胞cluster，但需要进一步的工作来确认这一特性。

在 scRNA-seq 和 snRNA-seq 中，整个肝细胞的捕获效果一样好；然而，中心静脉 (CV1) 肝细胞在 snRNA-seq 中的频率几乎是 scRNA-seq 的两倍（17% 对 9%；P < 10-30）。相比之下，区域间肝细胞在 scRNA-seq 中最常见（15% 和 9% 对 8% 和 3%；P < 10-15）。尽管存在这些差异，但观察到几乎所有与肝细胞相关的途径都在 snRNA-seq 衍生的肝细胞中表现出升高的表达。通过 snRNA-seq 在 CV1 肝细胞中鉴定的几个重要基因未通过 scRNA-seq 鉴定，而门静脉周围肝细胞的基因表达模式在两种技术中显着相关。区域间肝细胞存在最大的不一致，其中许多在 snRNA-seq 中上调的基因在 scRNA-seq 中下调。这可能反映了由于 scRNA-seq 所需的解离，肝细胞内的活力差或细胞状态被破坏，而用 snRNA-seq 检查肝细胞时不存在这种解离。因此，尽管捕获率相似，但 snRNA-seq 可能比 scRNA-seq 提供更好的肝细胞表征。

CHOLANGIOCYTES

胆管细胞是排列在胆管内的上皮细胞，占总胆汁量的 30%。 之前尝试仅使用 scRNA-seq 来表征这些细胞，仅鉴定了一个群体，其中包含 1.4%（8,444 个中的 199 个）表达胆管细胞标志物（上皮细胞粘附分子 [EPCAM]、SRY（性别决定区域 Y））的细胞 - 框 9 [SOX9] 和角蛋白 1 [KRT1])。 (差异还是很大)。

在本研究中，发现 snRNA-seq 捕获了更高比例的 KRT7、SOX9 和膜联蛋白 A4 (ANXA4) 表达胆管细胞（3.4% 对 2.4%），总共产生 448 个胆管细胞样细胞。 对这个 KRT7+ SOX9+ 群体进行亚聚类揭示了六个转录不同的亚群（标记为 Chol-1 到 Chol-6）。 鉴定了三个去唾液酸糖蛋白受体 1 阳性 (ASGR1+) 肝细胞样cluster、两个典型的胆管细胞样cluster（KRT7、KRT18 和溶质载体家族 4 成员 2 [SLC4A2] 高）和一组祖细胞，其中 82% 来源于snRNA-seq。 这些cluster并非特定于特定样本或供体，表明它们不是批次效应或供体特定变异的结果。 相反，这些cluster形成了从双能祖细胞延伸到肝细胞和胆管细胞命运的分支轨迹。

在胆管细胞分支最分化的一端是 Chol-4 群，其中包含成熟的胆管细胞，表达分化的胆管细胞相关标志物（top DE：水通道蛋白 1 [AQP1]、KRT8、KRT18、KRT7、防御素 1 [DEFB1]、CD24 、聚合免疫球蛋白受体 [PIGR] 和 ANXA4)，其中许多对人类胆管具有高度特异性。此外，经典的胆管细胞通路，如细胞极性、离子转运、ABC 转运蛋白和许多免疫通路，在该cluster中上调的基因中富集。 该clusters的细胞以同等量度源自 scRNA-seq 和 snRNA-seq，并且显着上调的标记物，包括 AQP1、分泌型磷蛋白 1 [SPP1] 和 DEFB1，在两种技术中相对一致。 因此，成熟的胆管细胞可以通过 snRNA-seq 或 scRNA-seq 很好地表征。

分化程度较低的胆管细胞群 (Chol-5) 对 snRNA-seq 具有特异性（177 个细胞核对 33 个细胞）。胆管细胞特性通过关键转录因子（肝细胞核因子-1-β [HNF1B]、一切同源框 1 [ONECUT1] 和 SOX9）的表达和 WNT 信号、ABC 和离子转运蛋白的富集得到证实。根据 B 细胞白血病/淋巴瘤 2 (BCL2) 表达确定该clusters包含特定的小胆管细胞，而大胆管细胞不表达。通过免疫组织化学发现 BCL2 的胆管限制性表达证实了这一点。我们注意到该clusters中许多干性标记的高表达，这与先前关于这些胆管细胞分化程度较低的表型的报道一致。使用 snRNA-seq（CYP3A5、PPARG 共激活因子 1 α [PPARGC1A]、脆性组氨酸三联体二腺苷三磷酸酶 [FHIT]、含有黄素的二甲基苯胺单加氧酶 5 [FMO5]、色氨酸 2,3-双加氧酶 [TDO2] 和SOX6);然而，这些并没有在 scRNA-seq 中重述，随后强化了这一群体只能使用 snRNA-seq 来表征.

在对面分支的远端是 Chol-3，一个中央静脉肝细胞样细胞群，表达高水平的 CYP3A4、glypican 6 (GPC6) 和醛氧化酶 1 (AOX1)。 这些细胞与胆管细胞聚集在一起，因为它们高表达许多胆汁代谢基因（即 ATP 结合盒亚家族 A 成员 8 [ABCA8]、ABCA6、羟基酸氧化酶 1 [HAO1]、ABCA1 和 SLC27A2），表明参与胆汁功能。 有趣的是，这些细胞表达肝细胞核因子 4 (HNF4a)，它首先在祖肝细胞中表达，是肝细胞分化的中枢调节因子。

另外两个偏向肝细胞的clusters Chol-2 和 Chol-6 表达了一些典型的胆管细胞标志物（KRT7、SOX9 和 CD24），但也表达了早期肝细胞谱系定义转录因子（HNF4a、叉头盒 A2 [FOXA2]、prospero homeobox 1 [PROX1]、ONECUT1 和 ONECUT2），表明中间或祖细胞表型。 Chol-6 和 Chol-2 的高表达基因与祖细胞相关标志物相关，例如 FOXA2、成纤维细胞生长因子受体 3 (FGFR3)、多毛和分裂 1 增强子 [HES1] 和锯齿状规范缺口配体 1 (JAG1) 。 clusters之间的主要区别是 Chol-6 中增殖相关基因的表达，表明这些细胞是增殖性和非增殖性肝祖细胞。

在这些偏向谱系的分支的根部是一大群双能祖细胞（Chol-1），其中包含主要测序的单核（621 个核对 134 个细胞）。该cluster不表达成熟的胆管细胞标记，而是许多茎样和祖细胞标记的集合，包括 pou 5 类同源框 1 (POU5F1)、FOXO2、矮小相关转录因子 2 (RUNX2)、SOX6、CD133、丙氨酰氨肽酶、膜 (ANPEP) 和 SOX9。该cluster的这些特征与之前仅在体外观察到的双能祖细胞一致。此外，通过通路分析，确定了 NOTCH2 信号通路（notch 受体 2 [NOTCH2]，免疫球蛋白 kappa J 区的重组信号结合蛋白 [RBPJ ]，像转录共激活因子 2 [MAML2]、MAML3、MAML4) 作为这些祖细胞的一个关键特征。内胚层、细胞周期和细胞分裂途径在这个群体中相对于支持干样状态的其他集群而言是富集的。在空间转录组学数据和公开的免疫组织化学数据中，Chol-1 的标记基因（即 FOXO3、GATA 结合蛋白 6 [GATA6]、FGFR3 和 ANPEP）定位于胆管，表明这些可能是祖细胞生态位。

使用此处提供的组合图谱作为参考，能够使用自动注释工具 scmap-cell 来识别和标记在我们之前的地图中无法检测到的两个不同的胆管细胞子集。 我们从成熟胆管细胞 (Chol-4) 和少量双能祖细胞 (Chol-1) 中鉴定出细胞，这些细胞只能使用 snRNA-seq 数据进行鉴定，证明了我们组合的 scRNA-seq 和 snRNA-seq 的效用肝脏图谱。

LIVER MESENCHYMAL CELLS

各种间充质细胞群，如 HSC、成纤维细胞 (FB) 和血管平滑肌细胞 (VSMC) 已被提议作为致病性肌成纤维细胞的来源，它们通过产生细胞外基质蛋白促进肝损伤后的纤维化。设计理想的抗纤维化疗法专门针对疾病中的肌成纤维细胞，必须描述这些间充质细胞在稳态时的基础细胞功能。 以前的单细胞研究侧重于间充质的异质性，特别是疾病或损伤期间的 HSC，通常利用额外的细胞处理步骤来丰富这些细胞。 对我们的间充质细胞clusters进行亚聚类显示，健康肝脏中存在七个不同的群体 (Mes1-7)，其中只有 Mes1、2 和 4 包含用 scRNA-seq 捕获的 10 多个细胞，并且在所有样本中只有 Mes4 被两种方法大致相等地捕获。

总体而言，间充质细胞由 2.5% 的单核组成，是其 1% 捕获的单细胞的两倍多。 使用 snRNA-seq，我们揭示了健康肝脏中低频率存在的 VSMC 和 FB 的转录组。

在生理条件下，HSCs 保持静止和非增殖表型，并位于 Disse 空间中的 LSECs 和肝细胞层之间。活化的 HSCs 被认为是肝纤维化中肌成纤维细胞池的主要贡献者，其特征在于含有视黄醇的脂滴的丢失，收缩表型的发展，以及胶原蛋白和细胞外基质重塑蛋白的产生。 Mes1、5 和 7 表达 HSC 相关的视黄醇储存基因，而其余的则表达肌成纤维细胞相关的基因。为了进一步确定这些cluster的细胞特性，我们使用先前发表的来自健康和四氯化碳诱导的纤维化小鼠肝脏的荧光激活细胞分选的 HSC、FB 和 VSMC 的转录组特征进行了跨物种相关性分析。与健康和纤维化 HSC 特征密切相关的间充质cluster是 Mes1。 70% 的间充质细胞核由专门负责维生素 A 储存和代谢的静止 HSC（Mes-1 和 Mes-5）组成，RBP1、卵磷脂视黄醇酰基转移酶 (LRAT) 和磷酸二酯酶 3B (PDE3B) 高表达。Mes1 在肝细胞中特异性表达生长因子 (HGF)，它是肝脏再生和肝细胞分化和生长的关键生长因子，并显示出预期的神经元通路富集。 Mes5 表达抗原呈递基因并显示出与脂肪和水溶性维生素相关的通路富集、脂质转运和有机酸代谢。脂质代谢和纤维蛋白凝块途径和炎症相关基因的存在表明这些可能代表活化的 HSC。 Mes7 是表达 RBP1、HGF、LRAT 和核心蛋白聚糖 (DCN) 的最小细胞cluster，但许多淋巴细胞相关转录物的存在表明它们可能是双细胞。

来自 scRNA-seq 和 snRNA-seq 的 Mes2 和 Mes4 转录组与小鼠 FB 特征密切相关，而 Mes3 和 Mes6 与 VSMC 特征相关，而不是来自慢性纤维化小鼠肝脏的活化 HSC。 这些观察结果适用于 scRNA-seq 和 snRNA-seq。 Mes2 细胞是数据集中第二常见的细胞群（24% 的细胞核）。 与 Mes4（AOX1、PDE3D 和 PDE4D）相比，它们表达了更多的脂质加工基因，以及补体级联通路的富集，但缺乏典型的 HSC 标志物和强肌成纤维细胞标志物。 此外，该cluster还显示细胞因子和生长因子受体以及血管生成和增殖因子（即转化生长因子 1 [TGFB1]、2 型转化生长因子受体 [TGFBR2]）的表达，表明它们可能是肝 FB 。

其他三个非 HSC Mes clusters仅包含 10% 的间充质细胞核（1,069 个中的 112 个），并且包含组织重塑细胞类型的异质子集。肌成纤维细胞通常在肝损伤后出现，以响应细胞因子、局部损伤、生长因子和纤维化信号。与 Mes2 相比，Mes4 具有丰富的与炎症信号传导、胶原蛋白产生和基质重塑相关的通路，并表达高水平的纤维化和肌成纤维细胞相关基因。 Mes4 和 Mes6 都表达了几个激活相关基因 [ACTA2、分泌蛋白酸性和富含半胱氨酸 (SPARC)、转凝胶蛋白 (TAGLN)、1 型胶原蛋白 α 1 链 (COL1A1) 和 TIMP 金属肽酶抑制剂 1 (TIMP1)]，并富集两个clusters中的途径包括胶原蛋白形成、细胞外基质和整合素信号传导。此外，Mes4 富含衰老相关通路和炎症基因（白细胞介素 32 [IL-32]、集落刺激因子 1 [CSF1]、TNF 超家族成员 10 [TNFSF10]、CC 基序趋化因子配体 2 [CCL2] 和 IL6ST )，表明更活跃的 FB 表型。 Mes6 表达 VSMC 标志物，如钙调蛋白 2 (CNN2)、肌球蛋白轻链 9 (MYL9)、TAGLN 和 ACTA2、高水平的纤维化生长因子，并富含收缩表型，表明 VSMC 处于纤维化状态。 Mes3 细胞核也表达 ACTA2、MYL9 和 TAGLN，但不表达胶原蛋白或基质重塑物或静止的 HSC 基因。相反，这个cluster富含支持血管生成和局部细胞增殖（细胞凋亡）的基因，表明 VSMC 状态的激活程度较低

空间转录组学独立证实 HSC 基因表达（Mes1 和 5）更高并分散在整个肝组织中，而 VSMC（Mes3 和 6）和 FB（Mes2 和 4）主要位于门静脉周围区域，如前所述。 由于这些clusters中的大多数主要在 snRNA-seq 数据中被识别出来，因此 snRNA-seq 数据中的大多数差异表达基因在 scRNA-seq 样本中没有被识别为显著性，这增强了捕获肝间充质细胞的联合方法的价值。

当然还有其他细胞类型的比较，这里我们就不再过多介绍了。

Discussion

比较应用于四个健康人肝脏样本的 scRNA-seq 和 snRNA-seq protocols揭示了几个显着差异。这两种技术都产生了高质量的数据，可以阐明人类肝脏中的主要细胞分类。然而，细胞类型频率在 scRNA-seq 中被扭曲，这主要是由于与实质细胞相比，免疫细胞对组织解离的弹性。这些差异会影响每种方法对描述相应细胞类型亚型的敏感性。 SnRNA-seq 能够检测胆管细胞和间充质细胞的许多其他细胞亚型，这些细胞亚型使用 scRNA-seq 难以区分。例如，该数据集中提供的小管胆管细胞的转录谱可作为评估小管胆管病变（如原发性胆汁性胆管炎 (PBC)）中的胆管细胞与健康肝脏中的胆管细胞在转录上的差异的参考。 此外，该平台可能允许区分知之甚少的自身免疫性肝病的细胞lanscope差异，例如区分 PBC 和原发性硬化性胆管炎，原发性硬化性胆管炎是一种主要影响大胆管的疾病。

肝内免疫landscope的完整表征对于了解肝病的发病机制也至关重要。 尽管细胞核分析具有优势，但许多重要的免疫细胞标志物在 snRNA-seq 数据中完全不存在。 例如，在我们的 snRNA-seq 样本中没有检测到 T 细胞或 B 细胞受体成分。 因此，我们建议调查肝内免疫群体的研究使用 scRNA-seq。

snRNA-seq 克服与组织解离相关的限制并以高分辨率捕获实质细胞的能力为详细检查健康和疾病中实质细胞和非实质细胞之间的相互作用开辟了一条途径。 此外，在冷冻组织中执行 snRNA-seq 的能力可以以单细胞分辨率检查生物样本库。 总之，我们已经证明单细胞和单核 RNA-seq 从正常肝脏样本中生成高质量数据，使用 snRNA-seq 可以更好地检查稀有肝脏基质细胞，包括 FB、HSC 和 VSMC，以及实质细胞 如胆管细胞。 该组合数据集可以对实质细胞复杂性进行复杂检查，并为单细胞肝病研究提供基础。

Method

首先来关注一下单核数据和单细胞数据的整合方法

DATA INTEGRATION AND CLUSTER

The data were integrated using default parameters of Harmony,then clustered using Seurat’s SNN-Louvain clustering algorithm.The data were clustered using 30 sets of parameters, and the most consistent clusterings were identified using apcluster on the cluster–cluster distance matrix calculated using the Variation of Information criterion.The full description of data integration and clustering can be found in the extended methods.

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