使用limma进行两组间的差异分析

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limma这个R包可以用于分析芯片数据，也可以分析NGS测序的数据，其核心是通过线性模型去估算不同分组中基因表达量的均值和方差，从而进行差异分析。

limma也是基于raw count的定量方式，但是它并不提供归一化的算法。在官方手册中，推荐采用edgeR的TMM归一化算法。完整代码如下

1.  读取文件

读取基因在所有样本中的表达量文件，示例如下

gene_id ctrl-1 ctrl-2 ctrl-3 case-1 case-2 case-3
geneA 14  0  11  4  0  12
geneB 125 401 442 175 59 200

每一行为一个基因，每一列代表一个样本。读取数据的代码如下

# 读取表达量的表格
counts <- read.table(
  "gene.counts.tsv",
  header=T,
  sep="\t",
  row.names=1,
  comment.char="",
  check.names=F)
 
# 设置样本分组
group <- factor(rep(c("control", "case"), each = 3))
design <- model.matrix(~group)
 
# 构建edgeR中的对象
library(edgeR)
y <- DGEList(counts=count)

之所以采用edgeR来读取数据，是为了方便后续的预处理和归一化。

2. 过滤count数很低的基因

和edgeR中的预处理过程类似，根据CPM表达量对基因进行过滤，代码如下

keep <- rowSums(cpm(y)>1) >= 2
y <- y[keep, , keep.lib.sizes=FALSE]

3. 归一化

默认采用TMM归一化算法，计算每个样本的 sizefactor, 代码如下

y <- calcNormFactors(y)

4. 表达量转换

在进行差异分析前，需要对表达量进行转换，有以下两种选择

1. logCPM

2. voom

第一种转换就是计算logCPM值，第二种转换适用于样本间sizaFactors差异较大的情况。转换的代码如下

# logCPM
logCPM <- cpm(dge, log=TRUE, prior.count=3)
# voom
v <- voom(dge, design, plot=TRUE)

5. 差异分析

转换之后的表达量就可以进行差异分析了，代码如下

fit <- lmFit(logCPM, design)
fit <- eBayes(fit, trend=TRUE)
res<- topTable(fit, coef=ncol(design))

上述代码采用的是logCPM值，当然也可以采用voom转换后的值，当采用voom转换时，注意trend参数为FALSE。

这里只是介绍了最简单的用法，更多复杂案例，比如多个分组，时间序列的差异分析等，请参考官方文档。

·end·

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