转录组之质量控制（FastQC）[学习笔记通俗易懂版]

转录组之质量控制（FastQC）

本文简介：这篇文章是经过了自己学习实践出来的，参考了很多资料，如若有大佬能指出错误，我将感激不敬，有错误，请在评论区留言，谢谢。
更新日期：2023年7月4号

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fastqc软件简介

FastQC是一个用于高通量序列数据的质量控制程序。FastQC可以读取并分析多种格式的序列数据，并且可以以交互的形式来检查几种不同的质量结果，或者创建一个可以集成到自动分析流程中的报告。该软件生成的结果是html格式文件，使用可以使用浏览器打开，非常便捷。

fastqc 软件的安装（Linux环境，不提供windows）

fastqc软件需要依靠java环境,我这里提供两种方式安装。

一、使用安装包安装，在fastqc官网下载安装包，但是这种方法需要预先安装Java环境（Jdk），如果你不确定是否安装了Java环境，请打开你的服务器（Linux系统）终端输入java -version，如果有java版本显示，则说明安装过了Java，如没有安装，则会返回Java未找到。（安装过Java的机器如下图）

如果没有安装Java环境，则需要预先安装java环境，安装步骤如下：

The fastQC software need java enviroment,so we must system had install java ,if not ,that we start to download java and dispose java enviroment

使用yum源安装：

yum install java  #使用yum源安装
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yum安装Java后，配置Java环境：

• 编辑/etc/profile文件

vim /etc/profile #edit this file and input the following content
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• 文件末尾输入以下内容，可以直接抄。

# java enviroment
JAVA_HOME=/usr/lib/jvm/jre-1.8.0-openjdk-1.8.0.372.b07-1.el7_9.x86_64
PATH=$PATH:$JAVA_HOME/bin
CLASSPATH=.:$JAVA_HOME/lib/dt.jar:$JAVA_HOME/lib/tools.jar
export JAVA_HOME CLASSPATH PATH
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• 重启/etc/profile文件

  source /etc/profile  #重启文件
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• 检查，使用查看Java版本的命令检查环境是否配置成功——java -version若不成功，请重新检查。如果看了抄了我的还是不成功，请看/usr/lib/jvm文件是否使用yum成功安装了java。

Java软件使用yum源是直接安装在了/usr/lib/jvm中。我们可以查看以下这个文件：

安装成功Jdk后我们浏览器搜索fastqc，找到其官网，我一般从GitHub下包。下面我举个例子：（请下载最新版，我的版本可能在你看的时候过时了）
方法一：（官网下载）
FastQC 官网地址（Babraham Bioinformatics - FastQC A Quality Control tool for High Throughput Sequence Data）

官网页面，可以参考下图标记位置下载fastqc，进入就可以看到安装包，复制其地址。后续可以使用 wget 下载。

方法二：（GitHub下载）
我一般从GitHub下载，GitHub上有最新版本。地址（Releases · s-andrews/FastQC (github.com)）

复制上图下载链接，使用 wget 命令下载。

• wget命令下载包（官网）

#download fastqc paskage
wget https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/fastqc_v0.12.1.zip
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• 解压文件

unzip fastqc_v0.12.1.zip
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如果你下了 .tar.gz文件，需要使用 tar 命令解压

tar -zxvf fastqc_v0.12.1.tar.gz
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( 我们下的安装包名称可能不一样，官网于github下的好像不一样，你需要根据你下载的实际情况去解压文件。),例如你下载到的文件名称为：v0.12.1.tar.gz

tar -zxvf v0.12.1.tar.gz
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解压后，在目录下会得到一个 FastQC 文件。该文件就是我们需要的，后续该文件位置用于配置环境，该文件内 bin 放的是可执行文件。

• 配置fastqc环境，在~/.bashrc文件（或者在其他文件配置）末尾加入以下代码：

#dispose enviroment
# fastQC
#格式如下：
#export PATH="包的路径：$PATH"
export PATH="/home/cyh/biosoft/FastQC: $PATH" #路径不一样，请勿完全抄，仅供参考
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• 重启文件：

# reboot file
source ~/.bashrc
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• 检查是否可行,help一下，如果有帮助信息，则成功，否者重新检查

fastqc --help
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二、上述我们使用了安装包安装，还有一种方法可以不用特意安装Java，我们可以使用生物学常用的工具miniconda3,推荐使用，应为很多生物学软件它都有，很方便。（ 或者anaconda3 ）

• 安装miniconda3，从官网下包安装，自己上官网找到下载地址，我这里使用wget命令下载安装包，同样推荐下最新版。下载后可以看到是个.sh脚本。

wget https://repo.anaconda.com/miniconda/Miniconda3-py310_23.1.0-1-Linux-x86_64.sh #下载
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• 运行.sh脚本。

bash Miniconda3-py310_23.1.0-1-Linux-x86_64.sh  #通过bash安装.sh安装包
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• 它会自动配置环境，不要动它。直接重启/.bashrc文件。

source /.bashrc    #重启.bashr
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• 重启文件后，如果命令行开头有base显示，这表示成功，如：

(base) [cyh@localhost ~]$
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• 安装miniconda3后，通过该软件安装fastqc,下面有两条命令，第二条命令最简单，第一条命令需要选择你期望的版本。（建议最新版）

conda search bioconda fastqc            #查询conda中是否有fastqc安装包，并返回所有版本
conda install -c bioconda fastqc                   #默认安装最新版fastqc
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• 检查安装是否成功，出现软件帮助信息表示成功

fastqc --help
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到此两种方式安装fastqc软件完成，若同学你未安装成功，且检查后无误，请找其他安装教程。

FastQC软件的使用

FastQC 支持 fastq、gzip 压缩的 fastq、SAM、BAM 等格式，在不指定文件类型的情况下，FastQC 会根据文件的名字来推测文件的类型: 以 .sam 或者 .bam 结尾的文件会被当作 SAM/BAM 文件来打开，并统计 mapped 和 unmapped reads 在内的所有 reads；其它的文件类型则被当作 fastq 格式打开。 其使用语法为：

fastqc [-o output dir] [--(no)extract] [-f fastq|bam|sam] [-c contaminant file] [-t threads] seqfile1 .. seqfileN

• [-o output dir]：指定FastQC输出结果的目录。默认情况下，结果将保存在当前工作目录中。
• [--(no)extract]：设置是否解压缩输入文件。FastQC可以对gzipped或bzipped的文件进行处理，解压缩文件能够提供更准确的结果。该选项默认为自动解压缩。
• [-f fastq|bam|sam]：指定输入文件的格式。可以选择fastq（默认），bam或sam。根据输入文件的类型选择合适的格式。
• [-c contaminant file]：指定一个污染物文件，用于检测和过滤掉可能存在的污染物序列。该文件包含了可能出现在样本中的污染物序列。
• [-t threads]：指定使用的线程数。FastQC可以利用多个线程加快分析速度。默认为单线程处理。
• seqfile1 .. seqfileN：输入的序列文件列表。可以指定一个或多个文件进行分析。

命令很简单，举例如下：

fastqc  -t 4 /home/cyh/*.fq -o /home/cyh/result/
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例子数据存放在 /home/cyh/中，输出到指定文件夹 /home/cyh/result/，使用了4个线程。

一个数据会生成两个结果，一个是 HTML 文件，一个.zip文件，我们需要查看的是 .html 文件。

(base) [cyh@localhost ~]$ ll -l /home/cyh/result
-rw-rw-r--. 1 cyh cyh 239289 Mar 31 15:53 xxx_fastqc.html # html 文件
-rw-rw-r--. 1 cyh cyh 239289 Mar 31 15:53 xxx_fastqc.zip
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对于生成的结果，我们只需查看html文件。（该文件可以使用远程传输工具传到Windows，例如：Xftp）

FastQC报告解读目的

大多数测序仪在其分析流程中会生成一个质量控制报告，但这通常只关注由测序仪本身产生的问题。FastQC旨在提供一个质量控制报告，该报告可以发现源于测序仪器或起始文库材料的问题。

基本生信分析流程（例如RNA-Seq）的第一步是对测序的原始数据fastq文件进行质量评估，做简单的质量控制检查，以确保原始数据的质量良好，且您的数据中没有可能影响到有用应用的问题或偏差。以便后续组装过程中丢弃低质量的片段，减少因测序错误而产生的影响。

THML结果解读

可参考地址：FastQC_Manual.pdf (missouri.edu)

我们使用浏览器打开html文件，对于生成的结果，我们只需查看html文件。
对于FastQC Report ，主要分为11个部分（有些生成出的结果不一，与你的质量有关），如图：

接下来我们来一一解读FastQC Report

• Basic Statistics 部分：
  
  该部分包括Filename（文件名）、File type（文件类型）、Encoding（测序平台）、Total Sequences（总序列数）、Sequences flagged as poor quality（低质量测序碱基数）、Sequence length（序列长度，给出最短和最长的序列长度，若是所有序列长度一致，则只给出一个值）和%GC（所有序列总的GC含量）。%GC：是我们需要重点关注的一个指标，这个值表示的是整体序列中的GC含量，这个数值一般是物种特异的，比如人类细胞就是42%左右。如果测序原始数据的GC含量远远偏离这个比例，说明测序数据存在一定偏好性，如果直接用测序数据，会影响后续的CNV和变异检测的分析。

• Per base sequence quality部分
  
  该部需要注意，图片上标注了各部分含义，箱线图应该位于蓝色部分就是合格的，黄色部分出警告，红色部分不合格；
  这是 read length = 100 的数据，横轴为read位置，纵轴是quality。quality = -10*log10( p)，p为测错的概率。根据quality给出质量结果：正常区间（28 - 40），警告区间（20-28），错误区间（0-20）。
  比如，当read的某一位置的p=0.01,quality=20，那么它就处于错误区间。
  本部分标准如下：如果任何一个位置的下四分位数小于10或者中位数小于25，会显示“警告”；如果任何一个位置的下四分位数小于5或者中位数小于20，会显示“不合格

• Per tile sequence quality部分
  
  该图片质量很好，下面展示局部不好的（因为本人没有不好的图）
  
  tile：每一次测序荧光扫描的最小单位。
  图中的颜色是从冷色调到暖色调的渐变，冷色调表示这个 tile 在这个位置上的质量值高于所有 tile 在这个位置上的平均质量值，暖色调表示这个 tile 的在这个位置上的质量值比其它 tiles 要差；一个非常好的结果，整张图都应该是蓝色，横轴代表101个碱基的位置；纵轴是tail的Index编号。
  检查reads中每一个碱基位置在不同的测序小孔之间的偏离度，蓝色表示低于平均偏离度，偏离度小，质量好；越红表示偏离平均质量越多，质量也越差。如果出现质量问题可能是短暂的，如有气泡产生，也可能是长期的，如在某一小孔中存在残骸，问题不大。
  合格标准：
  如果任何 tile 的平均质量值与这个位置上所有tiles的平均质量值相差2以上会显示“警告”，如果任何 tile 的平均质量值与这个位置上所有 tiles 的平均质量值相差5以上会显示“不合格”

• Per sequence quality scores部分
  
  序列平均质量频数。x轴是平均碱基质量值，y轴是平均碱基质量值对应的reads数。
  如果最高峰的质量值小于27( 错误率0.2%)则会显示“警告”，如果最高峰的质量值小于20(错误率 1 %) 则会显示“不合格”。上图显示本数据很好。
  低质量的会有两或多个峰

• Per base sequence content部分
  
  图中横轴为碱基位置，纵轴为碱基组成比例；
  一个完全随机的文库内每个位置上 4 种碱基的比例应该大致相同，因此图中的四条线应该相互平行且接近；
  在 reads 开头出现碱基组成偏离往往是我们的建库操作造成的，比如建 GBS 文库时在 reads 开头加了 barcode；barcode 的碱基组成不是均一的，酶切位点的碱基组成是固定不变的，这样会造成明显的碱基组成偏离；或者是测序仪状态不稳定。
  在 reads 结尾出现的碱基组成偏离，往往是测序接头的污染造成的，所以在开头会出现不规则波动。目前该问题好像没解决，但是可以减弱，比如减少接头污染。
  在序列前12~15个碱基，可以使用剪切软件切除，切除多少个需要看你的数据，比如上图的结果显示就可以切12个或13个。
  合格标准：
  如果任何一个位置上的 A 和 T 之间或者 G 和 C 之间的比例相差 10 % 以上则报“警告”，任何一个位置上的 A 和 T 之间或者 G 和 C 之间的比例相差 20 % 以上则报“不合格”

• Per sequence GC content部分
  
  上图的标记的双峰是我认为有影响的，请不要参考。
  这部分表示统计每个序列GC含量的频数。红色线是实际值，蓝色线是理论值。峰值位点对应着总体GC含量。在一个正常的随机文库中，GC 含量的分布应接近正态分布，且中心的峰值和所测基因组的 GC 含量一致。由于软件并不知道所测物种真实的 GC 含量，图中的理论分布是基于所测数据计算得来的；红色线于蓝色线越接近越好，越接近测序越好，越可靠。
  如果出现不正常的尖峰分布 (如本图)，则说明文库可能有污染 (如果是接头的污染，那么在 Overrepresented Sequences 那部分结果还会得到提示)，或者存在其它形式的偏选；
  合格标准：
  如果偏离理论分布的 reads 数超过总 reads 数的 15 % 则报“警告”，如果偏离理论分布的 reads 数超过总 reads 数的 30 % 则报“不合格”。

• Per base N content部分
  
  (上述图片来源于https://dnacore.missouri.edu/PDF/FastQC_Manual.pdf，其中25至31部分含有N值)
  在测序仪工作过程中，如果不能正常完成某个碱基的 calling，将会以 N 来表示这个位置的碱基，而不是 A、T、C、G；
  有时在序列中会出现较低比例的 Ns，尤其是靠近序列末端的位置，这说明系统不能正常的 call 这部分碱基；出现一定比例的 Ns 最常见的原因是普遍出现的质量丢失 (a general loss of quality)，这种情况可结合其它部分的结果来综合判断；另一种常见的现象是文库整体上的测序质量较高，但 reads 开头出现较高比例的 N，这可能是由于文库的碱基组成偏离的比较严重，测序仪不能给出正确的 call，这种情况可以结合 per-base sequence content 的结果来判断；该N的含量越小越好，为0是最最最理想的。
  合格标准：
  如果任何一个位置 N 的比例大于 5 % 则报“警告”，大于 20 % 则报“失败”。

• Sequence Length Distribution部分
  
  该部分是序列长度分布情况，上图例子显示，整个数据序列的长度分布于100~102之间。测序仪出来的原始 reads 通常是均一长度的，但经过质控软件等处理过的数据则不然；每个序列长度理论上完全一样的。
  合格标准：
  当 reads 长度不一致时报“警告”，当有长度为 0 的 reads 时则报“不合格”。

• Sequence Duplication Level部分
  
  横坐标为重复（duplication）的次数，纵坐标为reads的数目，以unique reads的总数作为100%
  合格标准：
  如果非唯一序列占总数的20%以上，该模块将发出警告。
  如果非独特的序列占总数的50%以上，该模块将发出一个错误。
  以下解释来源于

https://dnacore.missouri.edu/PDF/FastQC_Manual.pdf

一个多样化的文库中，大多数序列在最终集合中只出现一次。一个低水平的 重复率低可能表明目标序列的覆盖率很高，但是高重复率更可能表明某种富集偏差（如PCR过量）。重复程度高更有可能表明某种富集偏差（如PCR过度扩增）。该模块计算了序列集中每个序列的重复程度，并创建了一个 图显示具有不同重复程度的序列的相对数量。
为了减少该模块的内存需求，只分析每个文件中前20万个序列中出现的序列。分析每个文件中的前200,000个序列，但这应该足以对整个文件的重复程度有一个好的印象。但这应该足以对整个文件中的重复程度有一个好的印象。每个序列都被追踪到 每个序列都被追踪到文件的末尾，以提供总体重复水平的代表性计数。为了减少 为了减少最终图表中的信息量，任何有10个以上重复的序列都被放入10个重复的序列中。重复的序列都被放入10个重复的类别中–因此，在这个最终类别中看到一个小的 所以在这个最终类别中出现小幅上升是很正常的。如果你在这个最后类别中看到一个大的上升，那么它意味着你有 有大量的重复程度非常高的序列。

• Overrepresented sequences部分
  
  它展示了长度至少20bp，数量占总数0.1%以上的reads碱基组成，它可以帮助判断污染(比如：载体、接头序列)。（某一条序列占总序列的 0.1%，则被鉴定为过表达序列。）
  如果上面的GC含量分布图 "挂了 "，这个表可以帮助我们判断来源，如果是已知的载体或者接头，它会列出来；如果不是，可以复制序列去blast(这好像是个软件我没用过( ~ _ ~ )。
  标准如下：
  当发现超过总reads数0.1%的reads时报“WARN”，当发现超过总reads数1%的reads时报“FALL”。

• Adapter Content部分
  
  这部分衡量的是序列中两端adapter的情况
  如果在当时fastqc分析的时候-a选项没有内容，则默认使用图例中的四种通用adapter序列进行统计。本例中adapter没有去除，在72~90部分含有曲线翘起，在后续分析的时候需要先使用去接头软件进行去接头。

FastQC报告解读结束。

到此，本文内容结束，这篇文章是经过了自己学习实践出来的，参考了很多资料，如若有大佬能指出错误，我将感激不敬，有错误，请在评论区留言，谢谢。