Science：纽约西奈山医学院房刚组定量分析真核生物DNA 6mA解析细菌污染的影响...

https://www.science.org/doi/10.1126/science.abe7489

DNA甲基化对于人类发育和多种疾病有着至关重要的影响。过去几十年的研究主要侧重于5mC（5-甲基胞嘧啶）以及其去甲基化的产物。2015年Cell 发表3篇研究，报道藻类【1】、果蝇【2】和线虫【3】的基因组中具有6mA修饰。2016年Nature发表研究报道6mA修饰在小鼠胚胎干细胞中的功能【4】。随后一系列研究报道6mA在多种植物和动物中广泛存在，并在多种人类疾病中起到作用。这些研究虽然对于表观遗传学和表观组学的研究带来了新的机遇，但同时也提出了新的挑战。过去的几年里，多项研究报道了真核生物6mA研究中存在的一些质疑，比如说6mA抗体的非特异性【5】，细菌污染【5, 6】， RNA对于抗体的干扰【7】，DNA中整合的RNA m6A修饰残基【8，9】等等。这些质疑对6mA在真核生物中的存在和功能引发了一系列的讨论与思考（详细内容请参考：『珍藏版』综述 | “路漫漫其修远兮，吾将上下而求索”，DNA 6mA修饰研究全纪录）。

2022年，2月4日纽约西奈山医学院房刚团队在Science发表长文: Critical assessment of DNA adenine methylation in eukaryotes using quantitative deconvolution【10】，论文对DNA 6mA这一重要生物学问题持续探究，报道了使用“宏表观组”新方法，定量分析真核生物DNA 6mA并评估细菌污染的影响。作者认为目前真核生物DNA 6mA研究的最大挑战是缺少一个既能准确定量又能精确测序的分析技术。已有的方法中，质谱的定量分析非常灵敏，但是它无法有效分析细菌污染的影响。基于6mA抗体的共免疫沉淀的测序方法（DIP-seq）虽然可以有针对性的分析真核生物基因组，但是其无法进行6mA定量分析（同时，抗体的非特异性也为DIP-seq的分析带来了困扰【5】）。基于限制性内切酶的测序方法的只适用于特定的DNA基序(motif)，因此无法提供全面的定量分析。三代测序虽然可以检测DNA中的 6mA修饰，但是现有的方法主要适用于细菌和少量6mA含量高的单细胞真核生物【5, 11-13】，使用这些方法在大部分真核生物中检测DNA修饰需要非常谨慎。这篇Science文章中有详细讨论相关的技术细节。

为了有效处理上述挑战，文章利用宏基因组分析的策略开发了一个“宏表观组”方法6mASCOPE。其基本原理有三个方面：1）开发不依赖参考基因组的6mA分析方法，对样本中所有测序得到的DNA分子（200-400bp）逐一进行6mA分析，而不是只针对于感兴趣的真核生物基因组，从而包括了可能的细菌污染；2）获取三代测序底层数据并深入分析单个DNA分子信号以尽量减少6mA分析的背景噪音；3）利用机器学习算法对样本中不同物种、可能的细菌污染以及不同基因组区域进行6mA的分组定量。（图1）

图1：6mASCOPE“宏表观组”方法设计的基本原理

文章首先对6mASCOPE的方法进行了全面评测。通过实验混合多物种DNA，模拟获取大跨度的6mA/A水平的样本（丰度10^-2至10^-6) 。与独立的质谱数据对比，确认了6mASCOPE可以进行可靠的6mA定量分析。然后，作者利用6mASCOPE分析了两个单细胞真核生物：莱茵衣藻 (Chlamydomonas reinhardtii) 和四膜虫 (Tetrahymena thermophila)。已有的研究发现6mA在这两个物种中的含量非常高（~10^-2），并富集在转录起始位点附近的几个核小体间区【2】，但是对于6mA的精确定位尚不明确。文章作者利用6mASCOPE发现C. reinhardtii 中的6mA主要富集在核小体的边缘，而T. thermophila中的6mA更多的在两个核小体间区的中间（图2）。

图2：6mASCOPE定量分析发现6mA在两个单细胞真核生物中定位的共同性和区别。

接下来，作者对果蝇和拟南芥的DNA样本进行分析。之前的研究报道果蝇早期胚胎基因组中具有很高的6mA【2】。利用6mASCOPE，作者发现果蝇早期胚胎样本有少量微生物DNA，包括果蝇的食物（S. cerevisiae）以及肠道菌群（Acetobacter、Lactobacillus等）。说明即使是非常谨慎的实验操作，胚胎样本DNA的提取过程中仍会带入果蝇的肠道菌群。对这些物种进行分组的6mA定量分析，作者发现虽然整体样品中6mA含量很高，来自于果蝇基因组的6mA含量却非常低。相比之下，果蝇肠道细菌的6mA含量极高（此点与预期相符，绝大多数细菌中存在高丰度的6mA）。结合样品中不同组分的含量以及单独的6mA定量，文章发现来自果蝇基因组的6mA只能解释样品中1.44%的6mA。该分析说明即使是非常少的细菌污染，仍然可能对真核生物中6mA的研究产生巨大的影响。

图3：6mASCOPE定量分析发现果蝇肠道菌群解释样品中绝大部分6mA。

同样地，作者用6mASCOPE在拟南芥的根部提取的基因组DNA发现了少量的土壤微生物。这些土壤微生物同样具有很高的6mA水平，而拟南芥本身基因组的6mA含量却非常低，只解释了样本中～4%的6mA。

最后，参考之前的研究报道的6mA含量较高的人类细胞或组织类型，文章选择了人类血液细胞和脑部胶质瘤样本进行6mASCOPE分析。虽然作者并未发现类似于果蝇或拟南芥样本的显著细菌污染，但是这些人类细胞中的6mA含量却远低于先前的研究【14,15】。说明6mA的丰度可能远低于之前估计的的丰度、或者可能在人的不同临床样本、疾病亚型、细胞亚型和组织部位存在差异。同时，文章利用实验证明遗传操作中经常使用的质粒也会携带大量的6mA，因为这些质粒是通过大肠杆菌培养得到的。文章特别指出，即使敲除了大肠杆菌中的6mA 甲基转移酶Dam，基因组中仍会有很高的6mA残留，这是因为Dam并不是大肠杆菌中唯一的6mA 甲基转移酶（Nat Rev Genet发表房刚组细菌表观组综述论文, Nat Methods | 房刚团队开发新方法检测多种细菌DNA甲基化，助力细菌表观遗传学研究和菌群分析【12】和2021年Nature Methods纳米孔技术方法【13】）。

作者在文章中强调了以下几点。第一，文章的分析结果仅针对该研究中使用到的样本，并不排除在该项研究外存在高丰度6mA的多细胞真核生物的可能性。但是，作者建议利用6mASCOPE对高丰度6mA的真核样本进行细菌污染的定量分析, 从而排除其影响，最终帮助更可靠的研究真核生物中的6mA (图四)。 第二，6mASCOPE侧重于对于单个物种基因组以及特定基因组区间的6mA整体定量，而非单个位点的6mA检测。对于单个位点的6mA检测，尤其是在6mA含量较低的样本中，研究人员需特别谨慎分析中可能存在的假阳性。虽然该项研究基于PacBio单分子测序技术， 但是纳米孔测序及二代测序分析6mA的方法同样面临假阳性的挑战，也需谨慎对待。第三，作者强调三代测序对6mA检测的特异性 (specificity) 需要谨慎考量，建议结合质谱数据和6mASCOPE分析进行真核生物中6mA的定量。第四，虽然文章侧重于6mA的分析，另外一种DNA甲基化，4mC的分析同样需要引起注意，因为很多细菌中也包含高丰度的4mC。更全面的分析与讨论请见文章原文。

图4: 示例6mASCOPE 通过定量分析去除细菌污染，准确解析真核生物中的6mA。

孔艺萌为该文章第一作者。另外，曹蕾、Gintaras Deikus、范宇和Edward Mead为文章并列第二作者。6mA质谱分析由中科院汪海林课题组完成。罗格斯大学医学院张雪松助力细菌和拟南芥的分析。文章致谢Emory大学医学院姚冰课题组提供果蝇样本。

最后，房刚课题组 (http://fanglab.bio) 正在招聘博士后参与第三代测序在病原菌、宏基因组、人类表观基因组和疾病研究中的应用。

• 纽约伊坎医学院房刚组诚聘博士后: 表观基因组, 宏基因组, 精准医疗

原文链接：

http://doi.org/10.1126/science.abe7489

参考文献

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