Nature文章发现微生物群落动态研究绝对定量是关键，内标法比qPCR法定量更好（特异性、灵敏度和一致性更高）...

作者：你好赵伟 | 2024-05-19 10:17:26

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微生物亲缘性近能通过qpcr扩增吗

在微生物群落组成和多样性研究中，样本中绝对丰度的高低已经越来越受到人们的重视，这主要是由于传统的扩增子测序只能获得相对定量的数据，它无法全面准确的反映样本中微生物的真实丰度情况。在用相对定量结果与生理表型进行关联时，研究者可能会推导出错误的结论，妨碍人们对关键微生物的发现与挖掘。与此同时，目前微生物绝对定量检测的方法有多种，例如总DNA法、qPCR法、流式细胞术法和添加内标法等，究竟哪种方法相对更好一些，检测的特异性、灵敏度和一致性更高，许多研究者可能仍不十分清楚。

其实早在2021年发表在Nature上的文章，就从早产儿微生物群组装的驱动因素的角度，对上述问题进行了系统性回答。该文章结果发现，利用常规的相对定量数据，会推导出错误的婴儿微生物组的群落组装动态结果，而使用添加内标的绝对定量方法（MK-SpikeSeq），研究者获得了更加准确的结果，并成功用体内和体外实验加以证实。另外，相较总DNA检测法、qPCR法和流式细胞术，利用微生物内标法（Spike-in）进行的绝对定量测序方法，具有更高的特异性、灵敏度和一致性。

英文题目：Multi-kingdom ecological drivers of microbiota assembly in preterm infants

中文题目：早产儿微生物群组装的多界生态驱动因素

早产儿肠道菌群的发展是可以预测的，最初先锋菌种在肠道中定植，随后是其他微生物有序的生长变化。肠道菌群对早产儿的健康至关重要，但塑造这些可预测的微生物组的组装动力学因素仍未可知。

来自美国波士顿儿童医院、曼彻斯特大学生物科学学院、美国哈佛医学院、麻省理工学院和哈佛大学布罗德研究所的科研人员开发了一种添加内标的多界微生物群（细菌界、真菌界和古菌界）绝对定量测序方法（MK-SpikeSeq），通过生态建模和动物验证实验，研究了178名早产儿队列粪便中的细菌、真菌和古菌绝对定量动态情况，发现了微生物物种的大量繁殖和灭绝，并揭示婴儿肠道中的细菌和真菌丰度之间存在着负相关关系，进一步证明了可预测的组装动力学可能由特定微生物之间和环境依赖性的相互作用所驱动。

本研究揭示了微生物-微生物相互作用在塑造宿主相关微生物群中的核心作用，强调了绝对定量检测数据是微生物群组装动力学研究的关键，这些结果对于我们理解微生物群生态学和有针对性干预微生物群至关重要。

图1、MK-SpikeSeq能够对微生物绝对丰度进行有效的定量。a，示意图展示了相对丰度数据如何掩盖潜在的群落动态情况，使得区分不同的生态情景变得具有挑战性。b，MK-SpikeSeq流程概述。在DNA提取之前，将一定量的Spike-in内标菌（细菌（B）、真菌（F）和古菌（A））添加到每个样品中。然后使用标准的界水平特异性rDNA扩增子测序来进行绝对丰度的定量。由于每个Spike-in内标菌的rDNA绝对丰度是已知的，因此可当作反向归一化因子，来计算每个样品中存在的所有其他微生物的绝对丰度。添加内标菌还用作整个样品处理过程的内部对照，使绝对定量对诸如样品间DNA提取效率差异等因素具有鲁棒性。

图2、MK-SpikeSeq在检测灵敏度和对样品背景的鲁棒性方面优于qPCR。a，使用Escherichia coli和C. albicans的10倍梯度稀释，比较MK-SpikeSeq和qPCR之间的灵敏度。MK-SpikeSeq结果显示，在低细菌丰度样品中，相对于qPCR的灵敏度提高了约100-1000倍（仅检测10个细菌细胞）。对于E. coli样品的MK-SpikeSeq，使用两个梯度的Spike-in内标来覆盖每个样品约10000-100000个读序测序深度的整个检测范围。对于qPCR，水平虚线表示阴性对照（水DNA），垂直虚线表示下限阈值。低于该阈值时，16S测序产生少于100个读序（测序失败，可能是由于信号太低）。b，使用含有一定量E. coli和C. albicans以及可变数量 Caco-2 结肠细胞的测试样品，比较 MK-SpikeSeq 和 qPCR 对宿主细胞背景的稳健性。MK-SpikeSeq在具有高宿主细胞背景干扰的样品中检测到一致的（<2倍变化）微生物丰度，而qPCR方法在不同宿主细胞背景干扰的微生物丰度检测结果差别高达10倍以上（ΔCt> 3.3）。

本文完整解读请点击原文链接：Nature | 早产儿微生物群组装的多界生态驱动因素详细了解。

天昊生物Accu16S^®细菌和AccuITS^TM真菌绝对定量测序专利技术简介：

天昊生物开发的微生物Accu16S^®细菌与AccuITS^TM真菌绝对定量测序技术，就是一种基于添加内标序列的微生物绝对定量检测方法。本技术通过向样品DNA中添加天昊专利的人工合成已知拷贝数内标序列，然后进行16S扩增子文库构建、测序，再根据内标序列reads数及其绝对拷贝数绘制出标准曲线，最后可获得样品中OTU代表序列对应的细菌物种绝对拷贝数。利用该方法，我们可以同时获得绝对定量分析结果、常规扩增子相对定量结果，以及相对定量与绝对定量的比较分析结果，可谓“一次检测，三套结果”，数据更加全面准确。

天昊扩增子绝对定量测序技术优势：

一次检测，三套数据，结果更丰富；
对样本的需求量要求低，避免因样本无备份等造成的无法检测情况；
检测通量高，检测合格范围内各类菌种均可绝对定量；
相对定量和绝对定量数据相互印证，减少传统相对定量假阳性问题；避免跨平台qPCR定量的系统误差；
内标法比qPCR在定量上具有更高的特异性、灵敏度和更好的一致性；
避免因样本DNA抽提等原因造成的PCR抑制剂残留对结果准确性的影响；
避免qPCR等定量实验碰到的引物设计和优化难题。

取得成绩

截至目前，天昊客户利用微生物绝对定量测序共发表SCI文章42篇，其中JCR分区在Q1区的高分文章多达25篇，研究领域涉及医学、环境、食品、农学和生态等各个领域，样本类型包括人类及动物粪便、土壤、体外发酵液、水体生物膜、酒类发酵物及口拭子DNA样本等。

天昊客户文章中关于“绝对定量”和“相对定量”异同结果描述：

往期相关链接：

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