药物靶向结合中介孟德尔随机化分析，发表一区top文章，IF=11.1

编者

我们发现了一篇药物靶向孟德尔随机化研究，结合使用了中介孟德尔随机化，发表了一区top文章，统计分析方法较为详细，与各位做个分享！

2023年4月，一篇题为" Genetic association of lipids and lipid-lowering drug target genes with non-alcoholic fatty liver"的研究论文发表于《eBioMedicine》，文章属于中科院分区医学一区top期刊，IF=11.1。

这篇文章采用孟德尔随机化分析方法，旨在探讨脂质特征在非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）中的因果作用，并评估降脂药物靶点对NAFLD的潜在影响。结果表明，研究未发现脂质特性及8种降脂药物靶点对降低NAFLD风险影响的证据，证明脂蛋白脂肪酶（LPL）是治疗NAFLD的一个有希望的药物靶点。中介分析表明，LPL在NAFLD风险中的作用机制独立于其降脂作用，LPL对NAFLD发病风险的降低部分是通过降低2型糖尿病风险介导的。

一、研究摘要

背景：一些观察性研究发现，血脂异常是非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)的危险因素，降脂药物可能降低NAFLD的风险。然而，目前尚不清楚血脂异常是否是NAFLD的病因。这项孟德尔随机化(MR)研究旨在探讨脂质性状在NAFLD中的因果作用，并评估降脂药物靶点对NAFLD的潜在影响。

方法：从全球脂质遗传学联盟全基因组关联研究(GWAS)中提取了与脂质性状相关的遗传变异和编码降脂药物靶点的基因变异。NAFLD的汇总统计数据来自两个独立的GWAS数据集。通过相关组织的表达数量性状位点数据进一步检测达到显著意义的降脂药物靶点。进行共定位和中介分析以验证结果的稳健性并探索潜在的中介。

结果：脂质特征和8种降脂药物靶点对NAFLD风险无显著影响。在两个独立的数据集中，脂蛋白脂肪酶(LPL)增强的遗传模拟与较低的NAFLD风险相关(OR1 = 0.60 [95% CI 0.50-0.72]， p1 = 2.07 × 10−8;OR2 = 0.57 [95% CI 0.39-0.82]， p2 = 3.00 × 10−3)。皮下脂肪组织中LPL表达与NAFLD有显著的MR相关性(OR = 0.71 [95% CI, 0.58-0.87]， p = 1.20 × 10−3)和强共定位相关性(PP.H4 = 0.85)。空腹胰岛素和2型糖尿病分别介导了LPL对NAFLD风险总影响的7.40%和9.15%。

结论：我们的研究结果不支持血脂异常是NAFLD的病因。在9个降脂药物靶点中，LPL是NAFLD的一个很有前途的候选药物靶点。LPL在NAFLD中的作用机制可能独立于其降脂作用。

二、研究结果

1.血脂特征与NAFLD风险

77个与LDL-C相关的独立snp、50个与TG相关的snp和80个与TC相关的snp被确定为脂质性状的工具变量。在发现数据集中，基因相关性TG水平的增加与NAFLD风险的增加名义上相关。这一发现在复制数据集中未得到验证。

多变量MR分析中，包括TG、LDL-C和TC (OR = 1.18 [95% CI, 0.97-1.44];P = 0.09)。LDL-C或TC与NAFLD没有关联。

表1 脂质特征与非酒精性脂肪性肝病风险的孟德尔随机化结果

2.降脂药物靶点与NAFLD风险

在发现数据集(OR = 0.60 [95% CI 0.50-0.72]， p = 2.07 × 10−8)和复制数据集(OR = 0.57 [95% CI 0.39-0.82]， p = 3.00 × 10−3)中，相当于1 mmol/L (88.9 mg/dL) TG降低的LPL增强的遗传模拟与NAFLD风险降低显著相关。在发现队列中，APOC3抑制对NAFLD风险保护作用的遗传模拟也有类似的发现，但在复制队列中未得到证实。

其他药物靶点的遗传模拟物(HMGCR、NPC1L1、PCSK9、APOB、LDLR、ABCG5/ABCG8和ANGPTL3)对NAFLD结局的影响是中性的。

图1 来自两个独立数据集的9种降脂药物类别对NAFLD影响的遗传代理的关联

3.降脂药物的靶点和肝功能特征的风险

• LPL增强的基因模拟对肝脏脂肪、ALT、ALP 、GGT具有保护作用。在NPC1L1抑制的遗传模拟中也观察到类似的结果。

• 相比之下，APOB、LDLR和PCSK9对肝酶和/或肝脂肪有不良影响。

• 基因代理抑制HMGCR、APOC3和ANGPTL3对肝脏脂肪具有中性作用，对肝酶具有保护作用。

• ABCG5/ABCG8对肝脏脂肪有保护作用，但对肝酶有有害作用。

图2 9种降脂药物靶点对肝功能特征影响的遗传代理的关联

4.基因表达与NAFLD风险

由于LPL基因中降低TG的遗传变异显示出与较低NAFLD风险的独特关联，因此在基因高表达的全血和皮下脂肪组织中，与LPL表达相关的遗传变异被用作进一步验证的工具变量。血液组织和脂肪组织LPL表达增加1-SD与NAFLD风险降低相关。

图3 基因替代药物靶点与肝功能特征风险的关联

5.共定位分析

我们进一步进行了共定位分析，以确定相关组织中与LPL或APOC3表达相关的遗传变异与NAFLD共享因果snp的可能性。皮下脂肪组织中的LPL表达与NAFLD有一个共同的因果变异(PP.H4 = 0.85)。

而APOC3表达的共定位发现却没有得到很好的识别(肝组织:PP.H4 = 0.01;血液组织:PP.H4 = 0.01)。

6.中介分析

鉴于BMI、腰围、T2D和收缩压是NAFLD的公认危险因素，它们可能是LPL对NAFLD风险影响的中介。通过两步MR分析来研究LPL到NAFLD的介导途径。

在四个潜在的中介因素中，我们只确定了LPL和T2D风险之间的因果关系。LPL通过T2D对NAFLD的间接影响为0.95 (95% CI, 0.92-0.99;p = 0.03)(图A)。在调整T2D后，LPL对NAFLD的直接效应(β)从0.52 (95% CI, 0.31-0.74)降至0.47 (95% CI, 0.26-0.69)，表明LPL增强导致的NAFLD风险降低部分是通过降低T2D风险来调节的。两步顺式mr分析未发现异质性证据(p = 0.31)。

进一步的分析研究了血糖特征(即空腹胰岛素、空腹血糖和β细胞功能的稳态模型评估)作为LPL激活和NAFLD风险之间关联的介质的潜在作用。我们发现，降低空腹胰岛素水平适度介导了这种关联(中介比例:7.40% [95% CI, 1.70%-14.63%]， p = 0.03)(图B)。

三、统计学方法

1.研究设计大纲

2.研究暴露

• 血脂特征： 低密度脂蛋白胆固醇(low-density lipoprotein cholesterol, LDL-C)、 甘油三酯(triglyceride, TG)、 总胆固醇, (total cholesterol, TC)，数据来源于Global Lipids Genetics Consortium (GLGC)。

• 降脂药物靶点：HMGCR、NPC1L1、PCSK9、APOB、ABCG5/ABCG8、LDLR、ANGPTL3、APOC3和LPL。

3.研究结局

• 主要结局：NAFLD，发现数据来源于eMERGE (The Electronic Medical Records and Genomics)、UK Biobank(UKB)、Estonian Biobank、FinnGen；复制数据集来源于Anstee QM et al.

• 次要结局：包括肝脂率和3种肝酶，即丙氨酸转氨酶(alanine aminotransferase, ALT)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)、γ-谷氨酰转移酶(γ-glutamyl transferase, GGT)，数据来源于UK-Biobank (UKB)。

4.逆方差加权法

采用逆方差加权法(固定/随机效应)总体估计遗传替代的循环脂质性状对NAFLD的因果效应，以及遗传替代的降脂治疗对NAFLD和肝功能的因果效应。

5.孟德尔随机化分析

MR方法背后有三个基本假设:

• 遗传变异和暴露是强相关的(“相关性”)；

• 遗传变异独立于影响暴露与结果之间关系的混杂因素(“独立性”)；

• 遗传变异仅通过感兴趣的暴露(“排除限制”)影响结果。

为了检验相关性假设，用F统计分析评估每个遗传变异的强度。

为了验证我们对药物靶基因变异的选择，以冠状动脉疾病(CAD)和2型糖尿病(T2D)为结局进行了阳性对照分析。

6.共定位分析

对于达到NAFLD风险显著性的药物靶点，进行共定位分析以检验排除限制假设。它评估了与药物靶点和NAFLD相关的snp在给定位点上由相同的因果变异共享的概率(PP.H4)，以及药物靶点和NAFLD受彼此存在的不同因果变异影响的概率(PP.H3)。后验概率大于0.80支持测试配置。与NAFLD强共定位(PP.H4 > 0.80)的药物靶点被认为是潜在的靶基因。

7.中介分析

为了确定观察到的药物靶点与NAFLD之间是否存在直接关联，我们在MR分析中评估了遗传降脂疗法与先前确定的NAFLD危险因素(即体重指数[BMI]、腰围、T2D和收缩压)之间的关系。对于显著关联，可能存在潜在的中介效应(暴露-中介-结果通路)。

8.“两步Cis-MR”方法

在调整中介变量后，为了评估遗传降脂疗法对NAFLD风险的直接影响，采用了“两步Cis-MR”方法。与多变量MR方法相比，“两步顺式MR”方法可以减弱顺式MR分析中遗传变异高度LD相关的偏倚。

9.其他方法

• 采用Cochran’s Q检验和MR-Egger截距检验评估snp之间的异质性和多效性。

• MR敏感性分析采用多效性残差和离群值(MR- presso)来减少相关水平多效性引起的偏倚；对于不相关水平多效性，我们采用加权中值法和加权模式法。

• 为了评估去除药物靶标代理中单个有影响的SNP是否会影响因果效应的总体估计，进行了留一分析。

• 由于选择的替代药物靶点的遗传工具LD值较弱(r2 < 0.2)，我们使用LDmatrix Tool (https://ldlink.nci.nih.gov/)计算遗传变异之间的LD相关性，并在敏感性分析中调整LD结构。

• 对于显著的药物靶向MR关联，采用更严格的LD阈值(分别为r2 < 0.1、r2 < 0.01和r2 < 0.001)来检验我们观察结果的稳健性。

10.上述所有统计分析都是使用R(版本4.1.2)中的“TwoSampleMR”、“Mendelian Randomization”、“coloc”和“TwoStepCisMR”进行的。

后记

本研究采用药物靶向和中介孟德尔随机化分析方法，都是较为常用孟德尔随机化分析方法：

中介孟德尔：本质是中介理论应用于孟德尔随机。在暴露到结局的通路上找到一个起中介作用的表型。

药物靶向MR：即采用mRNA、蛋白质或者其它下游生物标志物作为暴露，相较于其它暴露表型（吸烟、饮酒、BMI等），由于在因果链上其距离结局更近，其分析结果会更稳健。

本文的统计分析方法过程比较详细，可供各位参考！

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